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手艺专栏

WB实验之内参选择

供稿：市场部

宣布时间：2023-06-14 金狮贵宾会-宾至如归-尊贵-显赫

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免疫印迹（Western Blot）在研究卵白相关实验中是要害手艺，由于实验周期较长、办法繁琐，影响因素较多，在实验历程中经�；嵊龅街种帜烟�。我们需要追根求源，查找并修复问题。今天我们解说下WB实验中内参的选择。

什么是内参及内参的作用

内参即是内部参照（Internal control），是指在组织和细胞中表达相对稳固的一类卵白质，通常由管家基因编码。这些卵白质被用作检测卵白表达水平转变时的参照物，以确定实验的准确性和可重复性。

在Western Blot实验中，我们使用内参着实就是使用与内参对应的抗体来检测内参的表达量。由于内参在差别组织和细胞中的表达量相对稳固，通过检测每个样品内参的表达量，我们可以校正上样误差，从而获得更可靠的半定量效果。使用内参还可以作为空缺比照，检测卵白转膜情形是否完全，并检查该实验中的显色或发光系统是否正常。通过选择合适的内参，可以将这些样本之间的差别消除或最小化，镌汰实验误差，提高效果的可靠性和可重复性。因此，选择合适的内参是Western Blot实验的要害办法之一。

怎样选择合适内参

样本种属泉源

凭证所做的卵白样本的种属确定，哺乳动物一样平常β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Na+/K+-ATPase等；植物样本一样平常选择Plant actin、Rubisco等；其他泉源样本应参考文献报道选合适卵白作为内参。

卵白表达位置

凭证研究工具的差别，选择差别的内参关于检测细胞中差别位置的卵白很是主要。一样平常情形下，选择β-actin和GAPDH作为总卵白的内参就可以知足要求。然而，关于细胞质、细胞核、细胞膜等差别位置的卵白检测，我们需要选择响应的内参，以确保实验效果具有科学性和可靠性。常用内参抗体分子量及其定位情形如下：

a.胞浆和全细胞卵白：β-actin（43kDa）、GAPDH（37kDa）、Tubulin（55kDa）等；

b.核卵白：PCNA（29kDa）、Histone H3（17kDa）、Lamin B (66kDa) 等；

c.胞膜卵白：Na+/K+-ATPase（100kDa）等；

d.线粒体卵白：COX IV（17kDa）、VDAC1（30kDa）等。

目的卵白分子量

在选择内参抗体时应思量目的卵白分子量巨细，通常要求目的卵白与内参卵白分子量相差5kDa以上。例如，若检测的目的卵白分子量为45kDa，则不宜选择分子量为42kDa的β-actin作为内参，应思量选择分子量为36kDa的GAPDH作为内参。

实验情形影响

在现实的实验情形中，处置惩罚条件可能会影响一些内参的表达，因此需要思量研究的信号通路是否会对内参的表达爆发影响。例如，在糖代谢的研究中，不可使用GAPDH作为内参，由于GAPDH是加入糖酵解历程中的酶，在某些细胞中，缺氧等条件会改变GAPDH的表达；在凋亡实验时，Lamin等也不适相助为内参；在加入抗有丝破碎和抗真菌药物时，Tubulin的表达易受影响，不适相助为内参等。因此，在设计实验计划的时间应思量这些因素并参考相关文献，在实验历程中，还需要注重内参表达是否泛起异常等因素的思量。

差别的组织特异性

actin 即肌动卵白，是细胞的一种主要骨架卵白。actin 大致可分为六种，其中四种是差别肌肉组织特异性的，包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin，其余两种普遍漫衍于种种组织中，包括beta-actin（β-non-muscle）和gamma-non-muscle actin。这些差别的亚型组织漫衍是纷歧样的，在肌肉组织中beta-actin漫衍就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此，差别的组织应选择差别的内参，不可一概而论。

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